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明胶酶谱分析试剂盒为什么老出不了条带,看过来!
发布时间:2018-10-17   点击次数:1709次

明胶酶谱分析试剂盒为什么老出不了条带,看过来!

很多老师反应在操作明胶酶谱试剂盒的时候,有时候很难出现漂亮的条带,信帆生物为您答疑解惑!

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1.样本失活

2.电泳操作不对,配胶不均,有气泡,温度控制不当等。

3.孵育时间不够。由于某些样本活性太低,孵育时间不够,很难出现漂亮的条带。

 

大家在明胶酶谱分析试剂盒时候的注意事项:

1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。

2.明胶酶谱的活性受钙离子,锌离子,和PH值等因素的影响,因此缓冲液配制应严格准确,尽量用超纯水,孵育温度也掌握好。

3.用大梳子

4.孵育液的PH在7.5-7.6,复性的TRITON时间长了会有絮状物,所以实验时尽量使用新鲜配置的。

5.孵育的37度不要在CO2培养箱中,因为会改变孵育液的PH值,在普通孵箱即可。

明胶酶谱分析试剂盒检测步骤:

1 制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶:推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS PAGE凝胶。将10 × substrate G 融化,并90 ºC 加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍,混匀后加入过硫酸铵和TEMED,等待凝胶聚合。

2 待测样品1:1 稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上样。切勿加热变性,并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量,使用普通蛋白预染Marker 即可。阳性对照(可选步骤):可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血与100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等体积混合,取5-15μl 上样。

3 低电流恒流电泳,每一块小胶电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

4 洗涤凝胶:取出凝胶,去除浓缩胶,放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶,然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸馏水稀释),室温漂洗凝胶2 × 30 分钟。中间换液。

5 孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释),室温或37ºC 孵育1~5 小时。阳性对照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小时即可显示。如MMP 活性低,应延长孵育时间为10小时或过夜。

6 显色:倒掉Buffer B,加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液(操作步骤见后面所附SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书)。凝胶的大部分区域被深染,在有MMP 条带的位置不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带。

7 条带扫描:将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明,但凝胶背景并非真正全黑。解决办法:可用非透射光扫描,或用App图像处理程序调整背景显示为灰度显示,并尽量设置为黑色。MMP 条带则为白色,这种背景黑条带白的格式是英文论文中zui常见的格式。

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上海信帆生物供应明胶酶谱分析试剂盒,操作简单,重复性好,灵敏度高,提供技术引导和售后服务!

?附上一张条带图:

 

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