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信帆生物为您分享:酶联免疫吸附实验(ELISA)要点
发布时间:2021-05-11   点击次数:63次

信帆生物为您分享:酶联免疫吸附实验(ELISA)要点

1 免疫吸附剂

  已包被抗原或抗体的固相载体在低温(2~8℃)干燥的条件下一般可保存6个月。有些不完整的试盒,仅供应包被用抗原或抗体,检测人员需自行 包被。以下简述固相载体和包被过程。

2 固相载体

  固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器,不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多,常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较 强的吸附蛋白质的性能,抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性,加之它的价格低廉,所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑料,可制成各种形式。

  ELISA载体的形状主要有三种:微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用,专用于EILSA的产品称为ELISA板,国际上标准 的微量滴定板为8×1296孔式。为便于作少量标本的检测,有制成8联孔条或12联孔条的,放入座架后,大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特 点是可以同时进行大量标本的检测,并可在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测,包括加样、洗涤、保温、 比色等步骤,对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线照射后,其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加,应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多,但 用于间接法测抗体时空白值较大。

  良好的ELISA板应该是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板 由于原料的不同和制作工艺的差别,各种产品的质量差异很大,因此,每一批号的ELISA板在使用前须事先检查其性能。

常用的检查方法为:以一定浓度的人IgG(一般为10ng/ml)包被ELISA板各孔,洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体,保 温后洗涤,加底物显色,终止酶反应后,分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件,使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部 读数的均数之差,应小于10%

  与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为ELISA固相载体,聚氯乙烯的特点为质软板薄,可剪割,价廉,但光洁度不如聚苯乙烯板,孔底亦不如 聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值也略高。

  为比较不同固相在某一ELISA测定中的优劣,可应用如下的试验:用其他免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和阴性标本,将它们进行一系 列稀释后,在不同的固相载体上按预定的ELISA操作步骤进行测定,然后比较结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果差别最大,这种载体就是这一 ELISA测定项目的最合适的固相载体。

  在ELISA中,用作固相载体的小珠一般为直径0.6cm的圆珠,表面经磨砂处理后吸附面积大大增加。ELISA板孔的吸附面积约为 200mm2,小珠均为1000mm2,将近ELISA板孔的5倍。吸附面积的增大即意味着固相抗原或抗体量的增加。再者,球型小珠的表面弧度更有利于吸 附的抗原决定簇或抗体结合位点的暴露面处于最佳反应状态,因此珠式ELISA的反应往往更为灵敏。小珠的另一特点是更易于使洗涤彻底,使用特殊的洗涤器, 使小珠在洗涤过程中滚动淋洗,其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好。但由于磨砂工艺的难度较大,小珠的均一性较差。

  小试管作为固相载体也有较大的吸附表面,而且标本的反应量也相应增加。板式及珠式ELISA的标本量一般为100-200ul,而小试管可 根据需要加大反应体积,标本反应量的增加有助于试验敏感性的提高。小试管还可以当作比色杯,最后直接放入分光光度计中比色。

  也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为ELISA固相载体的。其优点是表面积极大,反应在悬液中进行,其速率与液相反应近似。以含 铁的磁性微粒作为ELISA固相载体,反应后用磁铁的吸引进行分离,洗涤方便,试剂盒一般均配以特殊仪器。

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