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考马斯亮蓝法测蛋白含量的正确使用方法!
发布时间:2021-09-07   点击次数:93次

考马斯亮蓝法测蛋白含量的正确使用方法!

样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外,可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。


在酸性溶液中,考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合形成蓝色复合物;该复合物在595nm处有最大吸取峰, 其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。该方法灵敏度高,适合微量蛋白质分析。

使用所需设备:

产品组成:

试剂一:液体×1瓶,4℃保存。

标准品:液体×1瓶,4℃保存。

样品中可溶性蛋白质提取:

液体样品:澄清无色液体样品可以直接测定。

组织样品:准确称取约0.1 g样品,加1mL提取液(自备,根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水),冰浴匀浆,10000rpm,4℃离心10min,取上清,即待测液。(动物样品常常需要稀释)

吸光值测定:

1. 分光光度计预热30 min以上,蒸馏水调零。

2. 空白管:取0.5mL EP管,加入40μL蒸馏水,250μL试剂一,混匀后室温静置10min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于595nm比色,10~20min完成比色,记为A空白管。

3. 标准管:取0.5mL EP管,加入40μL标准液,250μL试剂一,混匀后室温静置10min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于595nm比色,10~20min完成比色,记为A标准管。

4. 测定管:取0.5mL EP管,加入40μL待测液,250μL试剂一,混匀后室温静置10min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于595nm比色,10~20min完成比色,记为A测定管。

蛋白质含量计算公式:

C待测(?g/m L)= C标准管×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)

                =50×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)

C标准管:标准品蛋白质浓度,50μg/mL。

注意事项:

1.加考马斯亮蓝后,在10~20min内吸光值相对较稳定,因此须在10~20min完成比色。

2.不宜用石英比色皿,可用玻璃或塑料比色皿,测完成后马上用95%乙醇冲洗。

3.测定前用1~2个样做预实验,确保蛋白浓度在0~100?g/ml范围内,否则需要做相应稀释。







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