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NI-NTA琼脂糖凝胶6FF的正确操作!
发布时间:2021-11-02   点击次数:104次

NI-NTA琼脂糖凝胶6FF的正确操作!

Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF是用于纯化6×His标签重组蛋白的一种纯化介质,它是由6%交联的Sepharose耦连了一种四齿螯合剂NTA而得.它可用于在非变性或变性条件下纯化任何表达系统表达的6×His标签重组蛋白。NTA,含有四个螯合区,较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni2+。6×His可与Ni2+螯合,从而使His标签蛋白结合在Ni-NTA纯化介质上,未结合的蛋白被洗涤下去,结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低pH缓冲液的温和洗脱下来,从而得到高纯度的目的蛋白。该纯化介质与His标签蛋白具有极高的亲和力,可达5-20mg/ml。可在非变性和变性条件下纯化任何表达系统所得的His标签蛋白。纯化程序简单,所得的蛋白纯度可高达95%。Ni-NTA可再生4-6次,重复使用。

Ni NTA琼脂糖凝胶6FF预先偶联Ni2+离子。通常,Ni2+是用于纯化重组组氨酸标签蛋白的优选金属离子,用咪唑进行洗脱。大家建议在含0.5-1.0 M NaCl的缓冲液,中性至弱碱性pH 7-8,这样的条件下结合,经常使用磷酸钠缓冲液。也可以使用Tris-HCl,但是在金属-蛋白质亲和非常弱的情况下应该避免,因为它可以降低结合强度,在缓冲液中避免螯合剂如EDTA或柠檬酸盐的存在。如果重组组氨酸标签蛋白表达为包涵体,则在所有缓冲液中包括高达6M Gua-HCl或8M尿素。当使用高浓度的尿素或Gua-HCl时,通常发生蛋白质解折叠。包涵体变性复性是个很复杂的过程,一般的建议纯化可溶蛋白。

注意事项:

1.上样之,样品必须经过膜过滤及去除色素,否则杂质及色素会被吸附到填料上,影响填料的正常使用。

2.在使用过程中,避免使用高浓度的强酸强碱,酸和碱的浓度应低于 0.1 摩尔。碱会使流速变慢。

3.不同的样品,吸附和洗脱方法不相同,可以根据相关的文献进行。



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