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细胞冻存液的原理及操作!
发布时间:2021-11-08   点击次数:160次

细胞冻存液的作用及操作!

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种,起到了细胞保种的作用。除此之外,还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。 细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%.15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO),可使溶液冰点降低,加之在缓慢冻结条件下,细胞内水分透出,减少了冰晶形成,从而避免细胞损伤。
原理:

细胞冷冻的原理在于尽可能降低细胞内的晶体形成,减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤,从提高细胞复苏时的存活率。细胞冻存的数量应保证复苏时低温保护剂获得1:10~1:20的稀释,稀释后的细胞浓度扔高于正常传代的细胞浓度为宜,这是因为当低温保护剂稀释10~20倍以后,该浓度一般不会对细胞造成毒性损伤。

操作步骤:

1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液;

2. 取对数生长期的细胞,去除旧培养液,用PBS清洗。

3. 去除PBS,加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来;

4. 离心1000rpm,5min;

5. 去除胰蛋白酶,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml;

6. 将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml;

7. 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操编辑;

8. 冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。

注意事项:

1.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存,但最好为对数生长期细胞。

2.将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤;

3.最好用新配制的培养液。



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