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ELISA的由来(酶联免疫的由来)
发布时间:2013-05-06   点击次数:2523次

酶联免疫吸附试验

 
96-well的孔盤 96-well的孔盘

酶联免疫吸附试验 (又称酵素免疫分析法 ,Enzyme-linked immunosorbent assay,簡稱ELISA )利用抗原 抗體之間專一性鍵結之特性,對檢體進行檢測;由於結合於固體承載物(一般為塑膠孔盤)上之抗原或抗體仍可具有免疫活性 ,因此設計其鍵結機制後,配合酵素呈色反應,即可顯示特定抗原或抗體是否存在,並可利用呈色之深淺進行定量分析。 酶联免疫吸附试验 (又称酵素免疫分析法 ,Enzyme-linked immunosorbent assay,简称ELISA )利用抗原 抗体之间专一性键结之特性,对检体进行检测;由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性 ,因此设计其键结机制后,配合酵素呈色反应,即可显示特定抗原或抗体是否存在,并可利用呈色之深浅进行定量分析。 根據待測樣品與鍵結機制的不同,ELISA可設計出各種不同類型的檢測方式,主要以三明治法( sandwich )、間接法( indirect )、以及競爭法( Competitive )三種為主,以下為各種方法之介紹。根据待测样品与键结机制的不同,ELISA可设计出各种不同类型的检测方式,主要以三明治法( sandwich )、间接法( indirect )、以及竞争法( Competitive )三种为主,以下为各种方法之先容。

三明治法

三明治法常用於檢測大分子抗原,一般之操作步驟為:三明治法常用于检测大分子抗原,一般之操作步骤为:

  1. 將具有專一性之抗體固著( coating )於塑膠孔盤上,完成後洗去多餘抗體将具有专一性之抗体固着( coating )于塑胶孔盘上,完成后洗去多余抗体
  2. 加入待測檢體,檢體中若含有待測之抗原,則其會與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結加入待测检体,检体中若含有待测之抗原,则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结
  3. 洗去多餘待測檢體,加入另一種對抗原專一之一次抗體,與待測抗原進行鍵結洗去多余待测检体,加入另一种对抗原专一之一次抗体,与待测抗原进行键结
  4. 洗去多餘未鍵結一次抗體,加入帶有酵素之二次抗體,與一次抗體鍵結洗去多余未键结一次抗体,加入带有酵素之二次抗体,与一次抗体键结
  5. 洗去多餘未鍵結二次抗體,加入酵素受質使酵素呈色,以肉眼或儀器讀取呈色結果洗去多余未键结二次抗体,加入酵素受质使酵素呈色,以肉眼或仪器读取呈色结果

三明治法分別以兩種抗體對檢體中的抗原進行兩次專一性辨認,因此專一性相當高,但此待測抗原必須是多價抗原,如此才可獲得兩種以上的專一性抗體,以分別進行夾心;而且此法需要足夠的表位空間以進行抗原抗體的夾心,所以並不適用於半抗原或小分子抗原等分子量較小之標的。三明治法分别以两种抗体对检体中的抗原进行两次专一性辨认,因此专一性相当高,但此待测抗原必须是多价抗原,如此才可获得两种以上的专一性抗体,以分别进行夹心;而且此法需要足够的表位空间以进行抗原抗体的夹心,所以并不适用于半抗原或小分子抗原等分子量较小之标的。

间接法

間接法常用於檢測抗體,一般之操作步驟為:间接法常用于检测抗体,一般之操作步骤为:

  1. 將已知之抗原固著於塑膠孔盤上,完成後洗去多餘之抗原将已知之抗原固着于塑胶孔盘上,完成后洗去多余之抗原
  2. 加入待測檢體,檢體中若含有待測之一次抗體,則其會與塑膠孔盤上的抗原進行專一性鍵結加入待测检体,检体中若含有待测之一次抗体,则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结
  3. 洗去多餘待測檢體,加入帶有酵素之二次抗體,與待測之一次抗體鍵結洗去多余待测检体,加入带有酵素之二次抗体,与待测之一次抗体键结
  4. 洗去多餘未鍵結二次抗體,加入酵素受質使酵素呈色,藉儀器(ELISA reader)測定塑膠盤中的吸光值(OD值),以評估有色終產物的含量即可測量待測抗原的含量。洗去多余未键结二次抗体,加入酵素受质使酵素呈色,借仪器(ELISA reader)测定塑胶盘中的吸光值(OD值),以评估有色终产物的含量即可测量待测抗原的含量。

竞争法

競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制,一般用於檢測小分子抗原,其操作步驟為:竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制,一般用于检测小分子抗原,其操作步骤为:

  1. 將具有專一性之抗體固著於塑膠孔盤上,完成後洗去多餘抗體将具有专一性之抗体固着于塑胶孔盘上,完成后洗去多余抗体
  2. 加入待測檢體,使檢體中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結加入待测检体,使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结
  3. 加入帶有酵素之抗原,此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結,由於塑膠孔盤上固著的抗體數量有限,因此當檢體中抗原的量越多,則帶有酵素之抗原可鍵結的固著抗體就越少,亦即,兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗體鍵結,即所謂競爭法之由來。加入带有酵素之抗原,此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结,由于塑胶孔盘上固着的抗体数量有限,因此当检体中抗原的量越多,则带有酵素之抗原可键结的固着抗体就越少,亦即,两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结,即所谓竞争法之由来。
  4. 洗去檢體與帶有酵素之抗原,加入酵素受質使酵素呈色,當檢體中抗原量越多,代表塑膠孔盤內留下之帶有酵素的抗原越少,顯色也就越淺。洗去检体与带有酵素之抗原,加入酵素受质使酵素呈色,当检体中抗原量越多,代表塑胶孔盘内留下之带有酵素的抗原越少,显色也就越浅。

當需要偵測無法獲得兩種以上單一性抗體的抗原,或是不易得到足夠的純化抗體以固著於孔盤上時,一般會考慮使用競爭法ELISA。当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原,或是不易得到足够的纯化抗体以固着于孔盘上时,一般会考虑使用竞争法ELISA。

 

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