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ELISA试剂盒检测方法的起源和原理
发布时间:2013-08-12   点击次数:808次

      酶联免疫检测技术(ELISA试剂盒检测方法)是20世纪60年代末期发展起来的一种免疫学检测方法,是目前zui广泛应用的标记免疫技术。1966年Nakene和Pierce共同发表了《酶标抗体:制备和抗原定位中的应用》,首先提出了酶联免疫技术(ELISA试剂盒检测方法)的基本原理。1971年Engvall和Perlmann发表《ELISA KIT方法吸附试验测定IgG含量》一文,使酶联免疫(ELISA试剂盒检测)技术成为一种实用的检测液体标本中微量物质的方法。目前酶联免疫(ELISA试剂盒)检测技术已广泛用于免疫学、微生物学、寄生虫学等。由于其具有灵敏度高、试剂稳定、设备简单、操作安全等优点,近几年也将其应用到食品领域中来检测某些食品中的生理活性物质。

一、基本概念
1、免疫:笼统地概括起来,免疫就是人和动物机体防御、排除外来物质(异物)进人体内,同时识别和清除体内死亡、变性物质和平定体内叛乱分子突变细胞,以保护和稳定自身的防护机制。
2、抗原:抗原是指那些能够诱导机体的免疫系统发生免疫应答,产生抗体和致敏效应淋巴细胞,并在体内外与之特异性结合,发生免疫反应的物质。
3、抗体:是能与相应的抗原专一性结合的蛋白质分子,和机体其他生物大分子一样是细胞的产物,分泌到体液中或表现在细胞表面上。
4、抗原、抗体反应:抗原和抗体在体外的反应亦称血清学反应。这类反应可借助免疫学方法进行检测。
二、抗体定量检测方法及其原理
定量分析抗体的常用方法有扩散法、酶联免疫吸附法和火箭免疫电泳法等。
1、免疫扩散法
1.1、单向免疫扩散法
原理:将待检抗原滴加于含相应抗体的琼脂板小孔中,经一定时间扩散后。形成乳白色的沉淀坏,在一定浓度范围内,抗原的含量与沉淀坏直径成正比。可以先用己知不同浓度的标准抗原制成标准曲线,再根据测试样品沉淀环直径的大小,从标准曲线上查出样品中抗原的相应含量。
1.2双向免疫扩散法
原理:可溶性抗原与已知可溶性抗体分别加入相邻的琼脂糖凝胶板上的小孔内,在电解质存在下让它们相互向对方扩散。当两者在zui适当比例处相遇时,即形成一条清晰的沉淀线。根据zui大稀释度与已知标准品zui大稀释度之比,可计算出抗体含量。
2、火箭免疫电泳法
原理:抗原在电场力的作用下向前移动,当抗原在通过含有一定量单一抗体的琼脂凝胶时,即形成抗原抗体复合物,比例合适即沉淀下来。因抗体迁移率低,而抗原随电泳向前移动,因而使抗原、抗体形成圆锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内,峰的高度与抗原的浓度呈正比。
3、酶联免疫吸附法((ELISA)
  原理:ELISA可用于测定抗体,也可用于检测杭原。其基本原理是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。3种必要的试剂: ①固相的抗原或抗体(免疫吸附剂); ②酶标记的抗原或抗体(标记物); ③酶作用的底物(显色剂)。
  ELISA过程包括:抗原吸附在固相载体上,这个过程称为包被,加待测抗体, 再加相应酶标记抗体,生成抗原--待测抗体--酶标记抗体的复合物,再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸取计算抗体的量。
  根据检测目的和操作步骤不同,有以下三种类型的常用方法:
3.1间接法  此法是测定抗体zui常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体。加人待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后,加人酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。
3.2双抗体夹心法  此法常用于测定抗原。将已知抗体吸附于固相载体,加人待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤,加人酶标板中。
3.3竞争法  此法可用于抗原和半抗原的定量测定,也可用于测定抗体。以测定抗原为例,将特异性抗体吸附于固相载体。加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原,使二者竟争与固相抗体结合;经过洗涤分离,zui后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。
三、酶联免疫吸附法测定抗体含量(竞争法)
1、仪器设备
酶联免疫检测仪(Bio-550);酶标板 (96孔);微量注射器。
2、试剂
 (1)HRP标记羊抗兔Ig G(1:1 000,国产);标准牛IgG;兔抗牛血清(1:256);
 (2)包被液:0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃,保存, Na2CO3 0.15g, NaHCO3 0.293g,蒸馏水稀释至100 mL。 
(3)稀释液与洗涤液:0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, 4℃,保存。NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween—20,0.5mL。蒸馏水加至1000mL。
(4)封闭液:含0.1%明胶0.01mol/L PBS, pH7.4。
(5)邻苯二胺底物溶液(临用前配制):临用前将Na2HPO4·12H2O 2.9g,柠檬酸0.51g溶于100mL蒸馏水中, 再加入40mgOPD,40μL30%H2O2。
(6)终止液:2mol/LH2SO4。于500mL蒸馏水中加入98%浓硫酸76mL混均即可。
3、操作方法
 (1)将抗原结合在酶标板上。取标准IgG(10mg/mL)用碳酸盐缓冲溶液稀释,得到浓度为0.1μg/mL的包被液,每孔加人100μL抗原包被液,并以不加标准抗原的两孔为对照,为反应的0%值,将反应板于4℃放置一夜(8个样品,分3个平行,4个100%值孔;共28+2孔)。
(2)标准牛IgG与初级抗体一兔抗牛血清的反应。将标准IgG(10mg/mL)用稀释液作二倍稀释得到一系列不同浓度的标准牛IgG(4μg/mL至0.325μg/mL)各200μL,加到入32倍稀释好的200μL的兔抗牛血清中,其中4个不加标准牛IgG作为测量时的100%值。4℃反应放置一夜。
(3)封闭板。将包被好的酶标板孔内液体倾去,进行洗涤,各孔加200μL洗涤液后室温下放置1min,倒掉,如此重复4次后,在吸水纸上拍干,加封闭液进行封闭,在37℃放置45min(注意:空白孔也要加封闭液)。封闭后,如前述洗涤。
(4)向酶标板中加人标准抗原和抗体的混合物。将标准牛IgG和兔抗牛血清的混合物取100μL加入到酶标板孔内,同是4个未加抗原的100%值的平行样也加入酶标板中。37℃放置2h,再洗板4次。
(5)加人HRP标记的羊抗兔Ig G。洗涤后每孔加100μL稀释好的HRP-羊抗兔IgG,37℃放置1h,洗涤。
(6)加人OPD底物。洗板4次后,每孔加人100μL底物溶液,于37℃暗处反应20min后,每孔加人50μL结束反应液以终止反应。
(7)吸取测定。用酶联免疫检测仪测定波长为492nm下的吸光值。
(8)数据处理。标准曲线是以Ig(标准牛IgG含量)对B/Bo作图,求得线性方程。其中,C为标准牛IgG含量;B为不同浓度标准牛IgG吸取值与0%吸取值之差;Bo为100吸取值与0%吸取值之差。
     

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