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你知道明胶酶谱法试剂盒是由什么组成的吗?
发布时间:2021-07-13   点击次数:143次

你知道明胶酶谱法试剂盒是由什么组成的吗?

 基质金属蛋白酶(mmp2/9)试剂盒适用: 检测 MMP-2MMP-9 酶谱及活性(Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM)。

 组成与储存 (50 assays)

1.2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml ?l, 20 ºC;
2.10 × Substrate G, 50 ml, 20 ºC;
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用时用蒸馏水稀释;

4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用时用蒸馏水稀释;

5. SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液, 4 ºC。

 

检测步骤:

1. 制备含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝胶:推荐分离胶浓度为 8%。按照标准程序制备 SDS- PAGE 凝胶。将 10 × substrate G 融化,并 90 ºC 加热 5 分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加 入 10 × substrate G 并使之稀释 10 倍,混匀后加入过硫酸铵和 TEMED,等待凝胶聚合。

2. 待测样品 1:1 稀释于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上样。切勿加热变性,并且仅 使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量,使用普通蛋白预染  Marker 即可。阳 性对照(可选步骤):可取人、小鼠、大鼠或兔 100?l 全血与 100?l 2 × SDS-PAGE non-

reducing buffer 等体积混合,取 5-15?l 上样。

3. 低电流恒流电泳,每一块小胶电流为 20mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

4. 洗涤凝胶:取出凝胶,去除浓缩胶,放入容器内.可先用适量蒸馏水冲洗凝胶,然后加入10ml

1× Buffer A(用蒸馏水稀释),室温漂洗凝胶 2 × 30 分钟。中间换液。

5.  孵育:倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释),室温或 37ºC 孵育 1~5 小时。阳性 对 照或者血中的 MMP 通常 37ºC 孵育 1 小时即可显示。如 MMP 活性低,应延长孵育时间为 10 小时或 过一夜。

6.  显色:倒掉 Buffer B,加入 SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液(操作步骤见 SDS-PAGE 凝 胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书)。凝胶的大部分区域被深染,在有 MMP 条带的位置 不被染 色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及 活性。阳 性对照将在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出现透明条带。

7. 条带扫描:将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然 MMP 条带透明,但凝胶背景并非真正全黑。解决 办法:可用非透射光扫描,或用App图像处理程序调整背景显示为灰度显示,并尽量设置为黑色.MMP条带则为白色,这种背景黑条带白的格式是英文论文中zui常见的格式。

 

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